Biyoinformatik ve Yeni Nesil Dizileme (NGS) Nedir?

Yeni nesil DNA dizileme teknolojilerinin uygulanmasıyla ilgili son bilimsel gelişmeler, bu büyük platformların genetik üzerindeki çarpıcı etkisini vurgulamaktadır. Bu yeni yöntemler, daha önce yapılan DNA hazırlama protokollerinden tüm genom okumalarına alanı genişletti ve hassas analiz seviyesine ulaştı. Yeni nesil dizileme, eski DNA örneklerinin dizilimi gibi yeni uygulamalara da olanak sağlamış ve çevresel olarak örneklerin metagenomik analizinin kapsamını büyük ölçüde genişletmiştir. Yeni nesil dizileme ve biyoinformatik birlikte ele alındığında, bu teknolojilerin genetik ve biyolojik araştırmalarda muazzam değişiklik getirmesi ve temel biyolojik bilgimizi arttırması için şaşırtıcı bir potansiyel var.

Çok çeşitli programatik dillerin uyguladığı matematiksel ve istatistiksel yöntemleri kullanan biyoinformatik; biyolojik bilgileri moleküler, hücresel ve genomik düzeyde düzenler, analiz eder ve yorumlar. Yeni nesil dizileme ve biyoinformatiğin birleşik gücü teşhis, tıbbi tedavi ve epidemiyolojik araştırmalar için hayati öneme sahiptir. Yakın gelecekte genetiğin sınırlarını zorlamaya ve klinik testleri dönüştürmeye devam edecek. Biyoinformatik algoritmalar ve veriler, biyolojide eyleme dönüştürülebilir bilgi sağlamaktadır. Bu bilgi küçük gen panellerinden tamamlanmış tüm genom analizlerine ilerlemektedir. Bu ilerlemelerle birlikte, analitik açıklamaları sağlayan yazılım ve sistemler gelişmiş biyoinformatik için artan bir ihtiyaç söz konusudur. Şimdi genetik test laboratuvarlarının önemli bir parçası haline gelmiştir.

DNA’nın Sekanslanması Klinikte Çok Fayda Sağlıyor

Genetikte, dizileme (sekanslama) işlemi bir nükleik asit molekülünün sıralı olarak yapısının ortaya konmasıdır. Yani DNA’yı oluşturan nükleik asitler nükleotidlerden oluşur ve sekanslama işlemi bu bazların (Adenin (A), Timin (T), Guanin (G), Sitozin (C)) sırasının belirlenmesidir. Nükleotid dizilerini dizileme teknolojisi yıllardır biyolojik araştırmalarda merkezi bir rol oynamıştır. Benzer şekilde, sekans değişimleri tıbbi uygulamalara büyük ölçüde katkıda bulunmakta ve dizileme işlemini klinikte bir dayanak noktası haline getirmektedir.

Klinik genetik, kalıtsal bir hastalığı teşhis etmek için DNA değişimlerini tanımlamaya ve genetik kökenli muhtemel fenotipleri açıklamaya dayanır. Giderek artan şekilde tıbbi onkoloji, somatik değişimleri veya tümörlere özgü dizileme değişimlerini tanımlamak için sekanslamayı kullanır. Somatik değişimlerin varlığı veya yokluğu klinisyenlere hastalığın seyri hakkında bilgi verebilir ve hatta tanıya yardımcı olabilir. Ayrıca, somatik değişimlerin belirlenmesi, birçok ilacın bu spesifik değişimlere, genlere veya metabolik yollara yönelik olması nedeniyle tedavi seçeneklerini önemli derecede etkiler.

Biyoinformatik Analizler Sanger Yöntemi ile Başladı

Yakın zamana kadar çoğu rutin sekanslama Sanger yöntemi kullanılarak yapıldı (birinci nesil sekanslama). Sanger sekanslama, sekans verileri oluşturmak için DNA polimerazın doğal özelliklerini ve aynı zamanda modifiye dideoksinükleotitleri kullanır. Sanger dizilimi teknikleri, DNA ve RNA’dan dizileme verisi üretebilir. Hemen hemen her genomik hedef hakkında epigenetik bilgi sağlayabilir. Bununla birlikte, Sanger dizilemesinin modern klinik pratikte uygulanmasını engelleyen temel sınırlamaları vardır. İnsan genomunun ilk dizilişinde kullanılan bu yöntem basit ve güvenilirdir. Ancak nispeten küçük uzunluktaki DNA’ların sıralı dizilişinde öncelikle kullanılır.

Sanger dizilimi, reaksiyon başına yalnızca bir hedef üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu hedef, maksimum yüzlerce nükleotit boyutuna sahiptir. Geniş bir hedef yelpazesinde büyük miktarda dizi bilgisi oluşturmak son derece zaman alıcıdır. Ayrıca, Sanger diziliminin duyarlılığı, tümör örneklerinde DNA değişimlerini tanımlamak için genellikle yetersizdir. Bu sınırlamalar daha hızlı, daha hassas ve daha kapsamlı dizileme ihtiyacını ele almak için yeni teknolojilerin geliştirilmesine yol açtı. Bu “yeni nesil dizileme” metodu yani “next generation sequencing (NGS)” yenilikçi laboratuvar tekniklerinin ve biyoinformatik hesaplama gücünün kombinasyonuna dayanır (1).

Yeni Nesil Dizileme Ne Vaat Ediyor?

Yeni nesil dizileme (NGS), dizilişe çok farklı bir yaklaşımdır. Bütün genom dizilimi, ekzon dizilimi, DNA-protein ve RNA dizilimi dahil geniş bir uygulama dizisini ifade eder. Sanger dizilemesinden daha hızlı ve ucuzdurlar, otomasyona elverişlidirler. Yeni nesil dizilimi kapsayan yöntemler çok hızlı bir şekilde gelişmektedir. Ancak şu anda büyük ölçüde, polony dizilimi, pyrosequencing, boya dizilimi (Illumina) ve ligasyonla dizilimi (Applied Biosystems) içerir (2).

NGS için pek çok uygulama var ve sürekli olarak yeni yöntemler geliştiriliyor. NGS uygulamaları için birkaç sınıflandırma vardır. Bunlar;

(1) Araştırmacılar, bilinmeyen organizmalardan yeni bir genom oluşturmak için kendiliğinden oluşan bir dizi birleştirme yöntemi kullanırlar. Bu kendiliğinden oluşan genom düzeneği “assembler” olarak adlandırılan bir alet gerektirir. Genom dizisi oluşturmak için bölgeleri üst üste gelecek şekilde hizalayarak yapboz gibi parçalanmış DNA okumaları bir araya getirilir.

(2) Mevcut bir referans genomu olan bir organizmadan genetik çeşitliliği tanımlamak için DNA dizilimi, RNA dizilimi ve epigenom dizilimi yapılabilir. DNA dizilimi durumunda, bütün genom NGS teknolojilerinde mevcuttur. Araştırmacılar, dizileme sonuçlarını referans genomlarla karşılaştırarak yapısal değişimleri, kopya numarası değişimlerini ve genetik değişimleri saptayabilirler.

(3) Dizilim ile transkriptom sonuçlarını analiz etmek için RNA’dan tamamlayıcı DNA’yı sentezlenir. NGS platformları için piyasada RNA hazırlama kütüphane kitleri vardır. RNA dizilimi, araştırmacıların RNA, gen füzyonu, mutasyonu incelemesini sağlar.

(4) Genomun düzenleyici mekanizmaları için, ChIP-Seq, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma yerleri gibi protein-DNA etkileşimlerini analiz etmek kullanılan bir yöntemdir. ChIP-Seq, canlı hücrelerde proteinlerin bağladığı DNA bölgelerini zenginleştirmek için ilgilenilen proteinler için antikorlar gerektirir. Birçok araştırma makalesi, genom çapında düzenleme ağlarını göstermek ve tahmin etmek için biyoinformatiğe dayalı ChIP-Seq’i kullanmıştır.

(5) NGS teknolojileri, mikrobiyal ekoloji bilim adamlarının, çevresel örneklerden gelen genetik materyalleri muazzam bir ölçekte incelemelerine izin veriyor. Bilim adamları çevresel örneklerden çıkarılan DNA’yı kullanabilirler.

Biyoinformatik Analizler Onkolojide Çok Etkili

NGS teknolojileri birçok alanda bilim insanlarına daha iyi kalite ve nicelik olanakları sunar. NGS ve hazırlama teknolojilerindeki birçok yeni yöntem ortaya çıkmıştır ve çıkmaya da devam edecektir. Ancak en önemli kullanım alanlarından birisi onkoloji-patoloji bilim dallarındadır.

Yeni nesil dizilemenin (NGS) hızı, doğruluğu ve artan satın alınabilirliği, bir kişinin hastalığını yönlendiren moleküler değişikliklere dayanan tedavi tasarlamayı içeren bir yaklaşımın ortaya çıkmasına yardımcı olmuştur. NGS’nin onkolojide, hekimlerin hastalarının tümörlerini, tümörün büyümesini yönlendiren genetik değişiklikleri hedeflemek için tasarlanan tedavilerle eşleştirmek üzere kullanımıdır (3-5).

Bazı çalışmalar, NGS’nin kanser hastalarında klinik olarak mutasyonları belirlemede faydasını göstermiştir. Örneğin, uluslararası bir veri paylaşım konsorsiyumu olan Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange (GENIE), dizileme işlemine tabi tutulan tümörlerin %30’unun mevcut bir hedefe yönelik ilaçların kullanımı ile tedavi edilebilecek bir mutasyonun varlığını göstermiştir.

Genom Analizi Tedaviye Yön Veriyor

Kanser hastalarının genomuna dayanan bir tedaviyle eşleştirmek için dizileme sonuçlarının kullanılmasıyla, hastaların sağkalımı ile ilgili faydalı sonuçlar göstermiştir. Tsimberidou ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, tümör mutasyonlarına uygun bir tedavi verilen ileri kanser hastalarında, tedavi başarısızlığı süresi 2,2 ile 5,2 ay arasında ve sekans eşleştirme tedavisi almayan hastalara kıyasla sağkalım 9 ile 13,4 aya kadardır. Benzer şekilde, Radovich ve arkadaşları DNA mutasyonlarına, kopya sayısı değişikliklerine veya mRNA seviyelerine uygun tedavileri olan hastaların sağkalımlarının, eşleşmeyen tedavi alanlara göre daha yüksek olduğunu bildirmiştir (6,7).

Yeni nesil dizileme panelleri, tek bir araştırma ile aynı anda birden fazla geni verimli, hızlı ve doğru bir şekilde hedefleyebilir. Ek olarak, bu paneller hem tümör hem de normal dokunun klinik örneklerini veya sadece tümör dokusunu kullanır. Kapsamlı biyoinformatik yoluyla tümörlerde gen mutasyonlarını, sayı değişimini ve gen füzyonlarını belirler.

Gen Mutasyon Profilleri Çıkarılıyor

Önceden tasarlanmış panel, en yaygın mutasyona uğramış genleri veya çeşitli kanserlerde harekete geçebilecek genleri kapsar. Öte yandan, spesifik olarak belirlenmiş veya tümöre özgü mutasyonda bulunan genleri araştırmak için özel paneller veya tümöre özgü önceden tasarlanmış paneller geliştirilmiştir. TP53 mutasyonları çeşitli kanserlerde geniş çapta tanımlanırken, bazı gen mutasyonlarının çoğu farklı kanserler arasında farklı tanımlanır. Örneğin, kolon kanseri için KRAS, NRAS ve BRAF mutasyonlarının genetik testi, diğer yandan akciğer kanseri için EGFR, KRAS, BRAF ve HER2 mutasyonları ve ALK, RET ve ROS1 füzyonları için gereklidir. Yapılan çalışmalar, gen mutasyon profillerinin farklı histolojik kanser alt tiplerinde bile farklılık gösterdiğini bildirmişlerdir. Bu nedenle, kişiye özgü ve hedefe yönelik tedavide gen mutasyonlarını belirlemek için her hasta için uygun dizileme panelini seçmek gerekir (8,9).

Dünyanın her yerindeki birçok kanser merkezi kendi kurum içi platformlarını geliştirmiştir. Örneğin, Memorial Sloan Kettering (MSK) Kanser Merkezi, 468 kansere bağlı genlerde yapısal yeniden düzenlemede tüm protein kodlama mutasyonlarını, kopya numarası değişikliklerini, seçilen promotör mutasyonlarını tespit edebilen hibridizasyon yakalama bazlı bir NGS paneli olan MSK-IMPACT (Kanser Hedeflerinin Entegre Mutasyon Profili) geliştirmiştir. 2017 yılında, MSK-IMPACT testi ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından tümör profili için onaylandı. MSK-IMPACT bugüne kadar 20.000’den fazla kanserli hastayı tümörlere ayırmıştır. MSK-IMPACT kullanan 10.000’den fazla hastadan gelen tümörleri sıralayan yeni bir çalışmaya göre, hastaların yaklaşık %37’sinde en az bir gen mutasyonu vardı ve %11’i genetik değişikliklerini doğrudan hedef alan tedavilere yönlendirilebiliyordu. FDA ayrıca küçük hücreli olmayan kolon kanserinde gen mutasyonlarını hedefleyen Oncomine Dx Target testini onayladı. Bu test EGFR mutasyonları, BRAF mutasyonları veya ROS1 füzyonları olan küçük hücreli olmayan kolon kanseri hastaları için belirli ilaçların seçimine yardımcı olmak için bir tanı aracı olarak kullanılır (10).

Biyoinformatik ve NGS Devrim Yaratabilir

Yeni nesil dizileme teknolojisi ve biyoinformatik, kişisel kanser tedavisinde devrim niteliğinde potansiyeli olan geniş bir araştırma alanı açtı. Bu alanın daha da geliştirilmesi, klinik karar vermede kullanılabilecek genom değişiklikleri hakkında gerçek zamanlı bilgiye ihtiyaç duymakta ve sağlam bir veri altyapısı, dizileme teknolojisinde sürekli iyileştirme, analitik araçların geliştirilmesi ve hedef ilaç odaklı preklinik ve klinik denemeler gerektirir. Sonuçta, yeni nesil dizileme ve biyoinformatik verileri, tedaviyi bireysel tümörlerde dinamik genom değişikliklere uyarlama konusunda klinisyenlere rehberlik etme potansiyeline sahiptir.

Hazırlayan: Gökhan Burçin Kubat

Kaynaklar

D.L. Duncan, N.M. Patel, in Diagnostic Molecular Pathology, 2017

Patrick M. Sluss, Frances J. Hayes, in Williams Textbook of Endocrinology (Thirteenth Edition), 2016

Bode A.M., Dong Z. Precision oncology-the future of personalized cancer medicine? NPJ Precis. Oncol. 2017;1:2. doi: 10.1038/s41698-017-0010-5.

Collins F. Precision Oncology: Gene Changes Predict Immunotherapy Response|NIH Director’s Blog. [(accessed on 10 November 2017)]; Available online:https://directorsblog.nih.gov/2017/06/20/precision-oncology-gene-changes-predict-immunotherapy-response/

Schwartzberg L., Kim E.S., Liu D., Schrag D. Precision oncology: Who, how, what, when, and when not? Am. Soc. Clin. Oncol. Educ. Book. 2017;37:160–169. doi: 10.14694/EDBK_174176

AACR Project GENIE Consortium AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discov. 2017;7:818–831. doi: 10.1158/2159-8290.CD-17-0151.

Tsimberidou A.-M., Iskander N.G., Hong D.S., Wheler J.J., Falchook G.S., Fu S., Piha-Paul S., Naing A., Janku F., Luthra R., et al. Personalized medicine in a phase I clinical trials program: The MD Anderson Cancer Center initiative. Clin. Cancer Res. 2012;18:6373–6383. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-1627

Takenaka M, Saito M, Iwakawa R, Yanaihara N, Saito M, Kato M, Ichikawa H, Shibata T, Yokota J, Okamoto A, Kohno T. Profiling of actionable gene alterations in ovarian cancer by targeted deep sequencing. Int J Oncol, 46: 2389-2398, 2015.

Saito M, Takenoshita S, Kohno T. Advances in targeted therapy and immunotherapy for treatment of lung cancer. Ann Cancer Res Ther 24: 1-6, 2016.

Zehir A. ve ark. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med, 23: 703-713, 2017.